FACTORS AFFECTING MICROTUBERIZATION OF POTATO(SOLANUM TUBEROSUM L.) IN TWIN-FLASKS TEMPORARY IMMERSION SYSTEM

Abstract

Potatoes are nutrient-rich and are economically important. To meet the quantity demands tissue culture technology is used for seed potatoes development and reduction of the importing cost of seed potatoes. In this study, modern tissue culture technology – temporary immersion bioreactor – was employed to enhance the production of microtubers that can be utilized as seed potatoes. Single-nodal explants in liquid culture in the twin-flasks temporary immersion system were cultured using MS liquid medium supplemented with 0.5 mg/L BA. To obtain the initial shoot explants the medium was fed to the explants every 8 hours, 2 minutes duration each time, for 3 weeks. Factors influencing microtuberization were examined. In the first experiment, the frequency and the period of liquid medium feeding were studied. In the temporary immersion system, the liquid medium was fed to the explants every 3 and 12 hours, for 2 and 20 minutes per feeding, using MS liquid medium with 90 g/L sucrose. After an experience period of 3 weeks results showed that microtuberization in the twin-flasks temporary immersion system was more efficient compared to that in the conventional solid medium culture. Specifically, 2-minute feeding every 12 hours was the most optimal condition, which yielded 90.00% microtuberization and an average of 1.93 microtubers per shoot. In the second experiment the effects of different initial shoot numbers (10, 20, and 30 initial explants per container of 300-mL liquid medium) were compared. It was found 20 initial explants per container to be the optimal number that gave rise to an average of 28.4 microtubers per container. After which, sucrose concentrations were varied in liquid medium (30, 60, 90, and 120 g/L). It was shown that higher sucrose concentrations promoted microtuberization. 90 g/L of sucrose was found to be the optimal concentration, while 30 g/L of sucrose was insufficient to induce microtuberization. In the 4th experiment the effect of cold stress on the initial explants was studied by incubating the explants at 4°C for 0, 8, 24, and 72 hours before entering the temporary immersion system. 8 hours of 4°C treatment was found to be the most optimal, especially when considering the generation of microtubers weighing ≥ 1.0 g, which was enhanced by 4.19 fold compared to the non-treatment. On the other hand, 24-hours cold treatment decreased the number of microtubers generated. The effects of heat stress was examined by heating the initial explants at 30°C, 40°C, and 50°C for 1 hour prior to entering the temporary immersion system and comparing results with the non-treatment. 50°C-preincubation was found to be the most optimal treatment, which increased the numbers of microtubers per shoot 1.23 fold and yielded more higher-weight microtubers (4.62 fold increase of ≥ 1.0-g microtuber generation). Finally, the resultant microtubers weighing < 0.20, 0.20-0.49, 0.50-0.99, and ≥ 1.00 g from bioreactors to soil were transferred to planting and grown in greenhouse condition. After 1 month of transfer 85-100% sprouting in microtubers which were incubated at 4°C in the dark for at least 1 month, were capable to develop into plants. The results demonstrated effective utilization of temporary immersion system to induce microtuberization for further industrial-scale plantation.

มันฝรั่งเป็นพืชที่มีคุณค่าทางโภชนาการสูงและเป็นพืชเศรษฐกิจสำคัญของประเทศไทย ปัจจุบันมีการนำเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเข้ามาใช้พัฒนาการผลิตหัวพันธุ์มันฝรั่ง เพื่อให้ได้คุณภาพและมีปริมาณมากเพียงพอต่อความต้องการของเกษตรกร อีกทั้งเพื่อลดปริมาณการนำเข้าหัวพันธุ์จากต่างประเทศซึ่งช่วยลดต้นทุนการผลิต ในการศึกษาครั้งนี้ได้นำเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ทันสมัย คือ ระบบจมชั่วคราว (temporary immersion bioreactor) มาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตหัวจิ๋วมันฝรั่งที่สามารถใช้เป็นหัวพันธุ์ได้ โดยนำชิ้นส่วนข้อเดี่ยวมันฝรั่งมาเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวด้วยระบบจมชั่วคราวแบบขวดแฝด ใช้อาหารเหลวสูตร MS ที่เติม BA 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร ให้อาหารเหลวทุก ๆ 8 ชั่วโมง นานครั้งละ 2 นาที เป็นระยะเวลา 3 สัปดาห์ เพื่อให้ได้ต้นมันฝรั่งตั้งต้นสำหรับใช้ในการทดลองต่าง ๆ เกี่ยวกับปัจจัยในการสร้างหัวจิ๋วในระบบจมชั่วคราว การทดลองที่ 1 ทดสอบผลของความถี่และระยะเวลาการให้อาหารเหลว โดยเปรียบเทียบการเพาะเลี้ยงบนอาหารแข็งกับการให้อาหารเหลวทุก ๆ 3 และ 12 ชั่วโมง นานครั้งละ 2 และ 20 นาที ใช้อาหารสูตร MS ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เติมซูโครส 90 กรัมต่อลิตร หลังการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 3 สัปดาห์ พบว่า การเพาะเลี้ยงในระบบจมชั่วคราวมีประสิทธิภาพของการผลิตหัวจิ๋วสูงกว่าการเพาะเลี้ยงบนอาหารแข็ง ทั้งในด้านการสร้างหัวจิ๋วและการเจริญเติบโตของหัวจิ๋ว โดยสภาวะที่เหมาะสมที่สุด คือ การให้อาหารเหลวทุก ๆ 12 ชั่วโมง นานครั้งละ 2 นาที มีเปอร์เซ็นต์การเกิดหัวจิ๋วและจำนวนหัวจิ๋วสูงที่สุด 90.00% และ 1.93 หัวต่อต้น การทดลองที่ 2 เปรียบเทียบผลของการใช้จำนวนต้นตั้งต้นที่แตกต่างกัน ได้แก่ 10, 20 และ 30 ต้นต่อภาชนะบรรจุอาหารเหลว 300 มิลลิลิตร พบว่า จำนวนต้นตั้งต้นที่เหมาะสม คือ 20 ต้นต่อภาชนะ ได้จำนวนหัวสูงถึง 28.4 หัวต่อภาชนะ การทดลองที่ 3 ทดสอบผลของระดับความเข้มข้นซูโครสแตกต่างกันในอาหารเหลว ได้แก่ 30, 60, 90 และ 120 กรัมต่อลิตร พบว่า ซูโครสความเข้มข้นสูงสามารถเพิ่มการสร้างหัวจิ๋วได้ดี โดยความเข้มข้นซูโครสที่เหมาะสมที่สุด คือ 90 กรัมต่อลิตร ส่วนซูโครสความเข้มข้นต่ำ 30 กรัมต่อลิตร ไม่สามารถกระตุ้นการสร้างหัวจิ๋วได้ การทดลองที่ 4 ทดสอบผลของความเครียดทางกายภาพแบบการให้ความเย็น โดยนำต้นมันฝรั่งมาให้ความเย็นอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นระยะเวลาต่าง ๆ ได้แก่ 8, 24 และ 72 ชั่วโมง เปรียบเทียบกับการไม่ให้ความเย็นก่อนนำไปเพาะเลี้ยงในระบบจมชั่วคราว พบว่า การให้ความเย็นเป็นระยะเวลา 8 ชั่วโมง มีความเหมาะสมที่สุด โดยกระตุ้นให้เกิดหัวจิ๋วขนาดน้ำหนักมากขึ้นเพิ่มสูงขึ้นอย่างชัดเจนเมื่อเปรียบเทียบกับการไม่ให้ความเย็น โดยเฉพาะหัวจิ๋วขนาดใหญ่น้ำหนัก ≥1.0 กรัมขึ้นไป เพิ่มขึ้นกว่า 4.19 เท่า แต่การให้ความเย็นเป็นระยะเวลานานตั้งแต่ 24 ชั่วโมงขึ้นไป ทำให้การสร้างหัวจิ๋วและการเจริญเติบโตของหัวจิ๋วลดลง การทดลองที่ 5 ทดสอบผลของความเครียดทางกายภาพแบบการให้ความร้อน โดยนำต้นมันฝรั่งมาให้ความร้อนอุณหภูมิต่าง ๆ ได้แก่ 30, 40 และ 50 องศาเซลเซียส เป็นระยะเวลา 1 ชั่วโมง เปรียบเทียบกับการไม่ให้ความร้อนก่อนนำไปเพาะเลี้ยงในระบบจมชั่วคราว พบว่า การให้ความร้อนอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส มีความเหมาะสมที่สุด โดยเพิ่มจำนวนหัวจิ๋วต่อต้นกว่า 1.23 เท่า และกระตุ้นให้เกิดหัวจิ๋วขนาดน้ำหนักมากขึ้นเพิ่มสูงขึ้นอย่างชัดเจนเมื่อเปรียบเทียบกับการไม่ให้ความร้อน โดยเฉพาะหัวจิ๋วขนาดใหญ่น้ำหนัก ≥1.0 กรัมขึ้นไป เพิ่มขึ้นกว่า 4.62 เท่า และในการทดลองที่ 5 ทดสอบการนำหัวจิ๋วมันขนาดน้ำหนักต่าง ๆ ได้แก่ <0.20, 0.20-0.49, 0.50-0.99 และ ≥1.00 กรัม ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงในระบบจมชั่วคราวมาทดสอบการออกปลูกในโรงเรือน หลังปลูกเป็นเวลา 1 เดือนพบว่า หัวจิ๋วทุกขนาดสามารถงอกต้นได้สูง 85-100% เมื่อผ่านการเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำ 4 องศาเซลเซียส ในสภาพมืดเป็นระยะเวลา 1 เดือนขึ้นไป และต้นที่งอกมีการเจริญเติบโตดี ผลที่ได้จากการศึกษาดังข้างต้นแสดงให้เห็นว่า การเพาะเลี้ยงในระบบจมชั่วคราวสามารถนำไปใช้เป็นแนวทางการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตหัวจิ๋วมันฝรั่งเพื่อการเพาะปลูกในระดับอุตสาหกรรมต่อไป