DEVELOPMENT OF MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION AND MOLECULAR SURVEY OF CANINE TICK-BORNE DISEASES IN CHIANGMAI

Abstract

Tick-borne diseases (TBDs) are caused by tick borne pathogens, which include Babesia canis, Hepatozoon canis, Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Trypanosoma evansi. These pathogens are typically carried by brown dog ticks (Rhipicephalus sanguineus) and biting flies (Tabanus spp.). In this study, we developed multiplex polymerase chain reaction (mPCR) for the detection of 18s rRNA gene of H. canis and B. canis, VirB9 gene of E. canis, GroEL gene of A. platys and VSG gene of T. evansi in canine blood. A total of 870 canine blood samples were collected. The results showed that the optimized annealing temperature for mPCR was 58 degree celsius. The least primer concentration for detection VSG gene of T. evansi was 500 nM, VirB9 gene of E. canis was 100 nM, GroEL gene of A. platys and/or 18s rRNA gene of B. canis and H. canis were 50 nM. The least DNA template concentration that could be detected by mPCR assay developed in this study was 101 copy numbers of E. canis and B. canis, 104 copy numbers of H. canis and 103 copy numbers of A. platys. Prevalence of TBDs in Chiangmai showed that 331 dog cases were singly infected with H. canis (38.0%), 6 cases with E. canis (0.7%), 5 cases with A. platys (0.6%), and 2 cases with B. canis (0.2%). No case was infected with T. evansi. In addition, 191 dog cases were co-infected with B. canis and H. canis (22.0%), 16 cases with H. canis and E. canis (1.8%), and 12 cases with H. canis and A. platys (1.4%). No co-infection with B. canis and E. canis, B. canis and A. platys, and E. canis and A. platys was detected. Eight dog cases were co-infected with B. canis, H. canis and A. platys (0.9%), 8 cases with B. canis, H. canis and E. canis (0.9%), and 2 cases with H. canis, E. canis and A. platys (0.2%). No co-infection with B. canis, E. canis and A. platys was found. Four dog cases were coinfected with E. canis, H. canis, B. canis and A. platys (0.5%). There were 285 dogs that were not infected with any TBD-associated pathogens. Statistical analysis revealed that TBDs were not associated with either gender or age group. In contrast, TBDs were associated with an availability of veterinary service in the distance of 10 km from the families where the dogs were raised.

โรคพยาธิในเม็ดเลือดของสุนัขเกิดขึ้นโดยอาศัยพาหะนำโรค คือเห็บแข็งสีน้ำตาล (Rhipicephalus sanguineus) และเหลือบ (Tabanus spp.) โดยมีเชื้อก่อโรค ได้แก่ Babesia ca- nis (B. canis), Hepatozoon canis (H. canis), Ehrlichia canis (E. canis), Anaplasma pla- tys (A.platys) และTrypanosoma evansi (T. evansi) การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบมัลติเพล็กซ์ที่มีความจำเพาะกับยีน 18s rRNA ของเชื้อ H. canis และ B. canis ยีน VirB9 ของเชื้อ E. canis ยีน GroEL ของเชื้อ A. platys และ ยีน VSG ของเชื้อ T. evansi ในสุนัข จากนั้นนำเทคนิคดังกล่าวมาใช้สำรวจความชุกของโรคพยาธิในเม็ดเลือดสุนัขในจังหวัดเชียงใหม่ งานวิจัยนี้เก็บตัวอย่างเลือดสุนัขจำนวน 870 ตัว นำมาตรวจหาสารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรคพยาธิในเม็ดเลือดสุนัข ผลการศึกษา พบว่า อุณหภูมิ annealing ที่เหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบมัลติเพล็กซ์ คือ 58 °ซ ความเข้มข้นของไพรเมอร์ต่ำสุดที่สามารถตรวจพบยีน VirB9 ของเชื้อ E. canis คือ 100 nM ยีน GroEL ของเชื้อ A. platys และ ยีน 18s rRNA ของเชื้อ H. canis และ B. canis คือ 50 nM และยีน VSG ของเชื้อ T. evansi คือ 500 nM ความเข้มข้นของดีเอ็นเอต้นแบบต่ำสุดที่สามารถตรวจพบสารพันธุกรรมของเชื้อ E. canis และ B. canis คือ 101 copy numbers เชื้อ H. canis คือ 104 copy numbers และเชื้อ A. platys คือ 103 copy numbers ความชุกของการตรวจพบสารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรคพยาธิในเม็ดเลือดสุนัขในจังหวัดเชียงใหม่ที่เป็นการติดเชื้อเพียงชนิดเดียวคือ H. canis ร้อยละ 38.0 (331 ตัว) E. canis ร้อยละ 0.7 (6 ตัว) A. platys ร้อยละ 0.6 (5 ตัว) B. canis ร้อยละ 0.2 (2 ตัว) และไม่พบการติดเชื้อ T. evansi ความชุกของการตรวจพบสารพันธุกรรมในสุนัขที่ติดเชื้อร่วมกันสองชนิดคือ B. canis และ H. canis ร้อยละ 22.0 (191 ตัว) H. canis และ E. canis ร้อยละ 1.8 (16 ตัว) H. canis และ A. platys ร้อยละ 1.4 (12 ตัว) และไม่พบการติดเชื้อ B. canis และ E. canis, B. canis และ A. platys, E. canis และ A. platys ความชุกของการตรวจพบสารพันธุกรรมในสุนัขที่ติดเชื้อร่วมกันสามชนิดคือ B. canis, H. canis และ A. platys ร้อยละ 0.9 (8 ตัว) B. canis, H. canis และ E. canis ร้อยละ 0.9 (8 ตัว) H. canis, E. canis และ A. platys ร้อยละ 0.2 (2 ตัว) และไม่พบการติดเชื้อ B. canis, E. canis และ A. platys ความชุกของการตรวจพบสารพันธุกรรมในสุนัขที่ติดเชื้อร่วมกันสี่ชนิดคือ E. canis, H. canis, B. canis และ A. platys ร้อยละ 0.5 (4 ตัว) สุนัขสุขภาพดีไม่พบการติดเชื้อพยาธิในเม็ดเลือดคิดเป็นร้อยละ 32.8 (285 ตัว) ผลการศึกษา พบว่า เพศ และอายุไม่มีความสัมพันธ์ต่อการติดเชื้อพยาธิในเม็ดเลือดสุนัข แต่การมีสถานพยาบาลสัตว์ในระยะ 10 กม. มีความสัมพันธ์ต่อการติดเชื้อพยาธิในเม็ดเลือดสุนัขอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ