FACTORS AFFECTING MICROPROPAGATION OF ANOECTOCHILUS BURMANICUS IN TEMPORARY IMMERSION BIOREACTOR

Abstract

Anoectochilus burmanicus is a terrestrial jewel orchid with outstandingly beautiful and marbled leaves. This orchid is also important for its medical applications. However, the amount of this Anoectochillus species in nature has dramatically declined, as the orchids are often smuggled out of the forest. As a result, A. burmanicus is considered as an endangered species. This research aimed to develop a method that increases the efficiency of in vitro propagation A. burmanicus. In the multiplication stage, single node explants were cultured on semi-solid media, i.e., ½ MS and MS with 0.25 mg/L TDZ and VW. After 12 weeks, it was found that ½ MS with 0.25 mg/L TDZ supplementation could induce shooting by an average of 2.7 shoots per explant. This number exceeded the MS with 0.25 mg/L TDZ and the VW media (2.2 and 1.1 shoots per explant, respectively). To examine the cytokinin effects, BAP or TDZ at the concentration of 0.25, 0.50, and 1.00 mg/L were added to ½ MS. After cultured for 12 weeks, it was shows that 0.50 mg/L of TDZ supplemented with ½ MS gave the greater shooting with an average of 3.1 shoots per explant. We also compared the influence of culture systems: semi-solid medium and temporary immersion bioreactor (TIB) with feeding every 6 and 12 h, for 5 and 10 min each time. At 12 weeks, the TIB system revealed more effective in shoot induction from single nodes than a semi-solid medium. The liquid feeding every 12 h for 5 min each time resulted in the highest number of shoots and shoot lengths (4.8 shoots per explant and 4.73 cm, respectively). To explore the conditions for the rooting stage, we compared the TIB system with semi-solid media using ½ MS containing 0, 0.25, 0.50, and 1.00 mg/L of IAA. At 12 weeks, we found that the TIB system is better enabled various growth aspects than the semi-solid media. In particular, the TIB-mediated cultivation with 1.00 mg/L IAA yielded the highest number of roots, root length, plant height, number of leaves, leaf area, fresh weight, and dry weight (3.1 roots per plant, 5.70 cm, 5.58 cm, 2.9 leaves per plant, 595.80 mm2, 1384.78 mg, and 99.89 mg, respectively). We then acclimatized the rooted plants from different treatments by transplanting them into peat moss for 4 weeks. We found all treatments with high survival rates and were not statistically different between 80-100%. In addition, we explored the growth in the TIB system with a rooting medium, ½ MS added with 1.00 mg/L IAA, under different lighting. We compared the cultures under LED white light and the combinations of red and blue lighting with the ratios of 1:1, 1:3, and 3:1. The LED red and blue in a 3:1 ratio was best to stimulate all growth aspects (except root number and leaf number). The root length, plant height, leaf area, fresh weight, and dry weight were the highest at 5.85 cm, 6.88 cm, 780.67 mm2, 1947.06 mg, and 164.22 mg, respectively. Subsequently, the rooted plants were transplanted into peat moss for 4 weeks. We found that all treatments were able to adapt well. The survival rates were as high as 90-100%, which were not statistically different. Our results have shown that A. burmanicus cultivation under the TIB system yielded better results than conventional semi-solid feed in both multiplication and rooting stages. Therefore, the TIB system can be developed as a guideline for more efficient propagation of A. burmanicus.

กล้วยไม้ดินนกคุ้มไฟ (Anoectochilus burmanicus) จัดอยู่ในกลุ่มกล้วยไม้อัญมณีที่มีความโดดเด่นสวยงามของใบ ยังมีความสำคัญด้านการใช้ประโยชน์ทางการแพทย์ แต่ในปัจจุบันปริมาณนกคุ้มไฟในธรรมชาติมีแนวโน้มลดลงเป็นอย่างมาก เนื่องจากถูกลักลอบเก็บออกมาจากป่าทำให้มีความเสี่ยงต่อการสูญพันธุ์ ในงานวิจัยนี้มุ่งเน้นการพัฒนาวิธีการเพิ่มประสิทธิภาพของการขยายพันธุ์นกคุ้มไฟในสภาพปลอดเชื้อ โดยการศึกษาในระยะการเพิ่มปริมาณยอดได้นำชิ้นส่วนข้อเดี่ยวมาเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งสูตรต่าง ๆ ได้แก่ สูตร ½ MS และ MS ที่เติม TDZ 0.25 มิลลิกรัมต่อลิตร และสูตร VW เมื่อเพาะเลี้ยงเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ พบว่า อาหารสูตร ½ MS ที่เติม TDZ 0.25 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถเพิ่มปริมาณยอดได้ 2.7 ยอดต่อชิ้นส่วน ซึ่งมากกว่าอาหารสูตร MS ที่เติม TDZ 0.25 มิลลิกรัมต่อลิตร และสูตร VW (2.2 และ 1.1 ยอดต่อชิ้นส่วน) ส่วนในการเปรียบเทียบผลของไซโตไคนิน คือ BAP หรือ TDZ 0.25, 0.50 และ 1.00 มิลลิกรัมต่อลิตร ที่เติมในอาหารกึ่งแข็งสูตร ½ MS เมื่อเพาะเลี้ยงเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ พบว่า การเติม TDZ 0.50 มิลลิกรัมต่อลิตร ทำให้ชิ้นส่วนข้อเดี่ยวมีการเพิ่มปริมาณยอดได้ดีที่สุด คือ 3.1 ยอดต่อชิ้นส่วน ส่วนการเปรียบเทียบผลของระบบเพาะเลี้ยง คือ อาหารกึ่งแข็งและระบบไบโอรีแอคเตอร์จมชั่วคราว (temporary immersion bioreactor: TIB) ที่มีสภาวะการให้อาหารทุก 6 และ 12 ชั่วโมง ครั้งละ 5 และ 10 นาที เมื่อเพาะเลี้ยงเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ พบว่า ระบบ TIB ให้ผลดีกว่าต่อการเพิ่มปริมาณยอดจากชิ้นส่วนข้อเดี่ยวเมื่อเปรียบเทียบกับอาหารกึ่งแข็ง โดยการให้อาหารเหลวทุก 12 ชั่วโมง ครั้งละ 5 นาที ทำให้มีจำนวนยอดและความยาวยอดมากที่สุด คือ 4.8 ยอดต่อชิ้นส่วน และ 4.73 เซนติเมตร ตามลำดับ สำหรับการศึกษาในระยะการชักนำให้ออกรากได้นำชิ้นส่วนยอดมาเพาะเลี้ยงในระบบ TIB เปรียบเทียบกับอาหารกึ่งแข็งและใช้อาหารสูตร ½ MS ที่เติม IAA 0, 0.25, 0.50 และ 1.00 มิลลิกรัมต่อลิตร เมื่อเพาะเลี้ยงเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ พบว่า ระบบ TIB สามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตด้านต่าง ๆ ได้ดีกว่าอาหารกึ่งแข็ง โดยการเพาะเลี้ยงในระบบ TIB และใช้อาหารที่เติม IAA ความเข้มข้น 1.00 มิลลิกรัมต่อลิตร ทำให้มีจำนวนราก ความยาวราก ความสูงต้น จำนวนใบ พื้นที่ใบ น้ำหนักสดและน้ำหนักแห้งของต้นสูงที่สุด คือ 3.1 รากต่อต้น, 5.70 เซนติเมตร, 5.58 เซนติเมตร, 2.9 ใบต่อต้น, 595.80 ตารางมิลลิเมตร, 1384.78 มิลลิกรัม และ 99.89 มิลลิกรัม ตามลำดับ เมื่อนำต้นที่ออกรากจากกรรมวิธีต่าง ๆ มาย้ายปลูกในพีทมอสเป็นระยะเวลา 4 สัปดาห์ พบว่า ทุกกรรมวิธีมีอัตราการรอดชีวิตสูงและไม่แตกต่างกันทางสถิติ อยู่ระหว่างร้อยละ 80-100 นอกจากนี้ได้ทดสอบการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนยอดในระบบ TIB ด้วยอาหารสูตรชักนำการออกราก คือ ½ MS ที่เติม IAA 1.00 มิลลิกรัมต่อลิตร โดยเปรียบเทียบการเพาะเลี้ยงภายใต้การให้แสง LED สีขาว และสีแดงร่วมกับสีน้ำเงินอัตราส่วน 1:1, 1:3 และ 3:1 เมื่อเพาะเลี้ยงเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ พบว่า การให้แสง LED สีแดงร่วมกับสีน้ำเงินอัตราส่วน 3:1 สามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตด้านต่าง ๆ (ยกเว้นจำนวนรากและจำนวนใบ) ได้ดีกว่าการให้แสง LED คุณภาพแสงอื่น ๆ โดยมีความยาวราก ความสูงต้น พื้นที่ใบ น้ำหนักสดและน้ำหนักแห้งของต้นสูงที่สุด คือ 5.85 เซนติเมตร, 6.88 เซนติเมตร, 780.67 ตารางมิลลิเมตร, 1947.06 มิลลิกรัม และ 164.22 มิลลิกรัม ตามลำดับ ต่อมานำต้นที่ออก รากในแต่ละกรรมวิธีไปย้ายปลูกในพีทมอสเป็นระยะเวลา 4 สัปดาห์ พบว่า ทุกกรรมวิธีมีอัตราการรอดชีวิตสูงถึงร้อยละ 90-100 ซึ่งไม่แตกต่างกันทางสถิติ ผลจากการศึกษาแสดงให้เห็นว่า การเพาะเลี้ยงนกคุ้มไฟในระบบ TIB ทั้งในระยะการเพิ่มปริมาณยอดและระยะการชักให้ออกรากให้ผลที่ดีกว่าการเพาะเลี้ยงด้วยอาหารกึ่งแข็งแบบดั้งเดิม จึงสามารถใช้ระบบ TIB เป็นแนวทางในการขยายพันธุ์นกคุ้มไฟให้มีประสิทธิภาพมากขึ้น