FACTORS AFFECTING STRAWBERRY MICROPROPAGATION IN TWIN-FLASK TEMPORARY IMMERSION BIOREACTOR FOR GROWING IN HYDROPONIC SYSTEM

Abstract

Strawberry is an essential economic fruit in northern Thailand. There is a great demand for strawberry seedlings for stolon production and yields. Pharachatan 80 is among the most popular strawberry cultivars. One potential approach for commercial-grade, high-quality strawberry production is the highly efficient tissue culture method using a temporary immersion bioreactor (TIB) system with a hydroponic nursery. Therefore, this study aimed to utilize the twin-flask TIB system to optimize the Pharatchatan 80 strawberry propagation. To examine shoot induction under an aseptic condition, the stolons with unexpanded and expanded leaves were sterilized with 10% Clorox® for 3 min or 0.1 % mercuric chloride for 2 min. It was found that 3-min sterilization of stolon with unexpanded leaves using 10% Clorox® was the optimal for shoot induction. There was only 40% of microbial contamination with this treatment, while the shooting rate was higher as 73.33%. Although the lowest microbial contamination at 26.66% was found when using 0.1% mercuric chloride, the treatment caused stolon damage, resulting in a dark brown color and a lower success rate of shoot induction. Furthermore, the role of culture systems in shoot multiplication was then evaluated. Here, the sterile shoot explants were cultured on a semi-solid medium or in liquid medium fed by the TIB system every 4, 8, 12, and 24 h for 5 or 15 min each time. The results showed that all TIB culturing methods could significantly induce several shoots more than culturing on the semi-solid medium. It was found that the 5-min liquid feeding every 12 h induced the highest shoot numbers (15.13 shoots/explant) and height (4.50 cm). On the other hand, culturing the explants on a semi-solid medium yielded only 7.14 shoots/explant on average. In addition, we tested shoot multuplication in the TIB system supplemented with 0.25 or 0.50 mg/L of cytokinins, including benzylaminopurine (BAP) and thidiazuron (TDZ). Interestingly, 0.25 mg/L BAP addition to MS medium could induce shoot proliferation up to 27.85 shoots/explant on average. Nonetheless, all cytokinin treatments evaluated in this study induced hyperhydric shoots. In particular, the 0.50 mg/L TDZ supplementation resulted in hyperhydricity at a 44.44% rate. In contrast, hyperhydricity was not found in the absence of cytokinins. Root induction was assayed with IBA at 0, 0.5, and 1.0 mg/L concentrations supplemented in semi-solid or liquid media (TIB). We found strawberries could regenerate roots without IBA; this resulted in long roots, tall shoots, and no callus formation. On the contrary, IBA led to shorter root regeneration. In addition, callus was often formed at the stem bases, necessitating the need for callus removal before planting. Further, we found that TIB promoted more root generation with better root length and stem height than the semi-solid medium. Transferring the plants to a hydroponic nursery with the dynamic root floating technique (DRFT), we found a 98.65% survival rate after two weeks. Importantly, all plants thrived while transferring to the hydroponic system with the nutrient film technique (NFT) for two more weeks. In addition, we evaluated the mutation of the strawberry plants in the nursery following the 6th, 7th, and 8th subcultures in the proliferation phase using the random amplified polymorphic DNA (RAPD) method. The offspring exhibited similar DNA profiles as the parents, indicating no mutation acquired during the propagation via tissue culture.

สตรอว์เบอร์รีเป็นผลไม้เศรษฐกิจที่สำคัญทางภาคเหนือของประเทศไทย ในปัจจุบันมีความต้องการต้นพันธุ์เป็นจำนวนมากเพื่อใช้ในการผลิตไหลและเก็บเกี่ยวผลผลิต โดยพันธุ์ที่ได้รับความนิยมสูง คือ พันธุ์พระราชทาน 80 แนวทางหนึ่งที่มีศักยภาพในการผลิตต้นพันธุ์สตรอว์เบอร์รีคุณภาพดีเชิงการค้า คือ วิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีประสิทธิภาพสูง โดยการใช้ระบบไบโอรีแอคเตอร์จมชั่วคราว (temporary immersion bioreactor system: TIB) ร่วมกับการอนุบาลต้นในระบบไฮโดรโพนิกส์ การศึกษาครั้งนี้จึงมุ่งเน้นการใช้ระบบ TIB แบบขวดแฝดเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการขยายพันธุ์สตรอว์เบอร์รี พันธุ์พระราชทาน 80 ในการศึกษาการชักนำให้เกิดยอดในสภาพปลอดเชื้อได้ทดสอบการนำชิ้นส่วนไหลแบบใบตูมและใบแผ่มาฟอกฆ่าเชื้อด้วยคลอร็อกซ์ 10% นาน 3 นาที หรือเมอร์คิวริกคลอไรด์ 0.1% นาน 2 นาที พบว่า การฟอกฆ่าเชื้อชิ้นส่วนไหลแบบใบตูมด้วยคลอร็อกซ์ 10% นาน 3 นาที เป็นวิธีการที่เหมาะสมในการชักนำให้เกิดยอด โดยพบการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์เพียง 40% และมีการเกิดยอดสูงที่สุดถึง 73.33% ส่วนการฟอกฆ่าเชื้อด้วยเมอร์คิวริกคลอไรด์แม้ว่าจะพบการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์ต่ำที่สุด คือ 26.66% แต่ทำให้ชิ้นส่วนไหลเสียหายเป็นสีน้ำตาลคล้ำและเกิดยอดได้ต่ำกว่า ในการเพิ่มปริมาณยอดได้ทดสอบการนำชิ้นส่วนยอดที่ปลอดเชื้อมาเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งเปรียบเทียบกับการเพาะเลี้ยงในระบบ TIB ที่มีการให้อาหารเหลวทุก 4, 8, 12 และ 24 ชั่วโมง ครั้งละ 5 และ 15 นาที ผลปรากฏว่า การเพาะเลี้ยงในระบบ TIB ทุกกรรมวิธีสามารถเพิ่มปริมาณยอดได้มากกว่าการเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งอย่างชัดเจน โดยการให้อาหารเหลวทุก 12 ชั่วโมง ครั้งละ 5 นาที ทำให้มีจำนวนยอดและมีความสูงยอดมากที่สุด คือ 15.13 ยอดต่อชิ้นส่วน และ 4.50 เซนติเมตร ตามลำดับ ในขณะที่การเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งทำให้มีจำนวนยอดเพียง 7.14 ยอดต่อชิ้นส่วนเท่านั้น นอกจากนี้ยังได้ทดสอบการเพิ่มปริมาณยอดในระบบ TIB โดยเปรียบเทียบชนิดและความเข้มข้นของไซโตไคนินที่แตกต่างกัน ได้แก่ benzylaminopurine (BAP) และ thidiazuron (TDZ) ความเข้มข้น 0.25 และ 0.50 มิลลิกรัมต่อลิตร ซึ่งพบว่า การเติม BAP 0.25 มิลลิกรัมต่อลิตร ในอาหารสูตร MS สามารถเพิ่มปริมาณยอดได้มากที่สุดถึง 27.85 ยอดต่อชิ้นส่วน อย่างไรก็ตามการเติมไซโตไคนินทุกกรรมวิธีทำให้ยอดเกิดลักษณะฉ่ำน้ำซึ่งเป็นความผิดปกติ โดยเฉพาะ TDZ 0.50 มิลลิกรัมต่อลิตร เกิดการฉ่ำน้ำสูงถึง 44.44% ในขณะที่การไม่เติมไซโตไคนินไม่พบการฉ่ำน้ำ ส่วนการชักนำให้ออกรากได้ทดสอบผลของความเข้มข้น IBA 0, 0.5 และ 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร และการเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งและในระบบ TIB เปรียบเทียบกัน พบว่า ต้นสตรอว์เบอร์รีสามารถออกรากได้เองโดยไม่จำเป็นต้องเติม IBA ซึ่งทำให้เกิดรากที่ค่อนข้างยาว ต้นค่อนข้างสูง และไม่เกิดแคลลัสที่บริเวณโคนต้น ส่วนการเติม IBA ทำให้มีจำนวนรากเพิ่มขึ้น แต่ทำให้รากสั้นลง และยังเกิดแคลลัสที่บริเวณโคนต้นอีกด้วย ซึ่งจะต้องกำจัดแคลลัสทิ้งไปเมื่อจะนำต้นออกปลูก นอกจากนี้การเพาะเลี้ยงในระบบ TIB ทำให้มีจำนวนราก ความยาวราก และความสูงต้นมากกว่าการเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็ง ต่อมาเมื่อนำต้นที่ออกรากไปย้ายปลูกในระบบไฮโดรโพนิกส์แบบ dynamic root floating technique (DRFT) พบว่า มีอัตราการรอดชีวิตสูงถึง 98.65% หลังย้ายปลูก 2 สัปดาห์ และเมื่อย้ายไปปลูกในระบบไฮโดรโพนิกส์แบบ nutrient film technique (NFT) อีก 2 สัปดาห์ พบว่า ต้นยังรอดชีวิตทั้งหมด มีการเจริญเติบโตดีและแข็งแรง นอกจากนี้ในการศึกษาการกลายพันธุ์ได้นำต้นสตรอว์เบอร์รีที่ออกปลูก ซึ่งได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีการย้ายเปลี่ยนอาหาร 6, 7 และ 8 รอบ ในระยะเพิ่มปริมาณต้น ทำการตรวจสอบการกลายพันธุ์ในระดับดีเอ็นเอด้วยเทคนิค random amplified polymorphic DNA (RAPD) โดยเปรียบเทียบกับต้นแม่ พบว่า มีแถบดีเอ็นเอที่คล้ายกัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่าไม่เกิดการกลายพันธุ์จากวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ